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            常見問題答疑

            常見問題答疑

            樣本相關
            Q:流式細胞儀分選的細胞,研究表達譜,做芯片要求最低量多少?分選的細胞 由于其相似性極大,因此,做生物學重復是否有意義?
            A:芯片要求最低量跟細胞來源的關系不大,只要質和量達到芯片最低標準即可。 做生物學重復是否有意義并不是一概而論,需要考慮客戶實驗的意義。如果單純去看流式分選出細胞之間的差異,可以不做生物學重復。
             
            Q:樣本少且量少是否可以做測序或上芯片?
            A:這個問題太過籠統,樣本少是有多少樣本?量少是每個樣本有多少量?我們 的芯片或測序都對樣本的質和量有明確的規定,請參考我們的取樣手冊。
             
            Q:做 miRNA 芯片,血液必須要 1-2ml 以上才能抽提嗎?
            A:芯片所需樣本量請參考我們的取樣手冊,并不是說必須要 1ml,而是指 1ml 的樣本量抽提出的 RNA 合格概率較高,在低于 1ml 樣本量的情況下,抽提失敗 的幾率會提高,RNA 的質量容易達不到一般的芯片要求,如果客戶希望用這樣 的樣本做,那么所有風險要由客戶方承擔。
             
            Q:最少需要做多少組芯片,也就是最小樣本量是多少,必須是一個腫瘤組織對 應一個正常組織嗎?能否多個腫瘤組織對一個正常標本?
            A:通常情況下最少需要做兩組芯片(實驗組/對照組),每組一般至少三個樣本理論上一個樣本也可以進行實驗。腫瘤與正常組織成對效果比較好,如果樣本獲得有困難或經濟條件有困難,正常組少一些也可以,如果正常組較少,正常組的 數據就可能無法代表正常組這個群體,會造成檢測結果的誤差;臨床來源的樣本 推薦每組 5 個或 5 個以上。
             
            芯片相關
            Q:基因芯片可以定量嗎?
            A:可以,基因芯片是一種定性半定量的檢測工具。
             
            Q:基因芯片與定量 PCR、PCR 芯片之間有什么不同?
            A:原理不同:PCR 芯片即利用 PCR 原理的芯片??梢院唵卫斫鉃闄z測范圍: 基因芯片>PCR 芯片>單個定量 PCR;準確性:單個定量 PCR>PCR 芯片>基因 芯片。
            擴增方式不同: 定量 PCR 是將標記有熒光素的 Taqman 探針與模板 DNA 混合后,在引物、dNTP 和聚合酶存在下,完成 95℃預變性 10 秒,95℃5秒, 60℃30 秒,72℃30 秒,40 環熱循環,遵守聚合酶鏈反應規律。 基因芯片中 的 RNA 的"擴增"就是所謂的反轉錄即以 RNA 為模板,在通用引物、dNTP 和反 轉錄酶存在下,合成一條與 RNA 模板互補的 DNA 單鏈為 cDNA,它與 RNA 模板形成 RNADNA 雜交體。隨后又在反轉錄酶的作用下,水解掉 RNA 鏈,再
            以 cDNA 為模板合成雙鏈 cDNA。反應的一般條件 65℃反應 10min、冰浴 5min、 25℃10min、37℃60min、70℃10min。

            Q:芯片的標準化數據/差異數據如何查看?
            A:所有數據表格的結果內都有文件說明,請參考文件說明對應查看。
             
            Q:我們做的實驗中,有野生型和基因敲除型小鼠,小鼠有年齡的需要,如果做 芯片,敲除型小鼠有年齡梯度的設定,野生型是否也要設置不同的年齡
            A:為什么在敲除小鼠上設定年齡梯度?如果年齡對性狀有影響或者需要研究不 同年齡組的小鼠,那么在野生型上也要設置同樣的分組;如果年齡對性狀影響不 大或者不需要研究不同年齡組的小鼠,那么在做敲除組的時候就沒有必要設置年 齡梯度,通常的實驗都會選取年齡相似的成年鼠。
            Q:做一個新基因的功能研究,新基因的序列是已知的,是用芯片還是測序能做
            A:如果做已知序列新基因的功能研究,可以選擇直接在細胞系中過表達或抑制該基因的表達來直接看對細胞功能的影響。如果是想用芯片或測序檢測新基因以 及新基因能夠影響的其他基因表達,請提供該基因的標準名稱或數據庫編號,如 果芯片有設計該基因探針,可用芯片;如果沒有可以選擇測序。

            Q:問:芯片的探針覆蓋率為 4,是指 4 個探針捕獲一個基因?4 個探針是一樣 的嗎?探針覆蓋率越大是不是需要的樣本量越多?
            A:覆蓋率對于每個基因不盡相同,一般理解為平均檢測一個基因使用多少個探 針或探針組,如果是 4,代表 4 個探針或探針組檢測 1 個基因(不是捕獲),一般來說 4 個探針都是不一樣的。覆蓋率一般用在測序中。

            Q:CGH 芯片與 Cyto 芯片區別
            A:CGH 芯片分辨率較低,最高的分辨率只能到 10KB,Cyto 系列芯片分辨率 較高,平均為 3-5KB;CGH 芯片無法檢測 SNP,Cyto 系列芯片可以檢測 SNP。 Cyto 系列芯片的準確度較高,CGH 有雙標,在一張芯片能同時檢測對照組和實 驗組。

            Q:客戶在甲基化芯片做不了的情況下如何推薦 mRNA 芯片
            A:看情況,客戶只想研究甲基化的情況下不可能推薦其他產品,如果客戶可以 接受非甲基化研究,在告訴客戶甲基化不可行之后,可以直接詢問客戶是否考慮 做其他層面的研究,如 mRNA

            Q:公司的質控標準
            A:我們公司依據 Affymetrix 提供的質控標準做的質控,質控標準如下所示: 雜交混合夜中加入內參試劑,即雜交質控中,每個樣本中的四個內參基因的信號 值如 BioB<BioC<BioD<Cre,樣本的芯片是合格的;原始信號值大于背景信號 值;檢出率是在 dabg 算法下,哪些探針是顯著表達的,P 表顯著,A 表不顯著; 陽性控制與陰性控制對照是用來檢測樣本中探針表達與不表達的情況,陽性為表達,陰性為不表達,且陽性探針與陰性探針比值大于 0.8,表示芯片檢測正常。

            Q:不做芯片,所有的數據都是來自數據庫,這樣做分析后再驗證是否有意義
            A:該問題一分為二來看:通常的研究項目,自己做實驗檢測數據比較好,實驗 設計、驗證、功能實驗等都可以根據自己的需要進行調整,如果用別人的數據也 是有意義的,但是會碰到如下問題:別人已經發現的結論無法使用,必須在舊的
            數據上找到新的結論,分析的難度增加;別人的樣本無法獲得,驗證難度增加。 如果是與大樣本量或人群相關的臨床研究,用多方數據進行分析是很有意義的。 可以通過不同人群,不同地方的數據來得出更有意義的結論。

            Q:affymetrix 探針設計和 aglient 探針設計的比較
            A:1,affymetrix 探針長度是 25bp,aglient 探針長度是 60bp。2,單個探針相比,探針長了特異性強,靈敏度低,探針短了靈敏度高,特異性差,Affymetrix芯片通過加大每個基因的探針覆蓋度,相當于十幾個探針連起來檢測,連起來的 長度比 60 個 bp 還長,彌補了它的特異性查的弱點,從而精確性高。3,aglient 探針長,在洗脫過程中,容易洗脫掉。
            Q:關于miRNA芯片檢測的數據,發現某一個miRNA信號值在一個樣本中顯示是P,而在另一個樣本中顯示A,針對這樣的miRNA,后續分析是否可用?
            A:數據解析的時,會對檢測值做一個判斷,如果P值小于0.01就認為是檢出標上P。相反,A認為沒有檢測出,即P/A數量大于或者等于50%,此miRNA方可使用。

            測序相關
            Q:測序后的分析是否能做,能做到什么程度?
            A:我們目前的測序分析只能做 RNA-Seq、外顯子捕獲測序和全基因組重測序, 物種僅限于有標準基因組的生物,分析程度見分析結果范例。

            Q:X10 可以測什么樣本?
            A:X10 專門用于測人全基因組的重測序。
                  X10 不可以用于測:人以外物種的任何文庫。

            Q:X10 的測序數據質量是多少?
            A:Illumina 對 X10 的測序數據質量承諾是:“%Q30 >= 75%”。

            Q:什么是半導體測序,有什么優勢?
            A:半導體測序是一種新型的測序技術,原理簡單來說就是使用半導體傳感器芯片,對 DNA 復制期間產生的氫離子進行實時的測定。芯片上密布了數百萬個微 孔,每個微孔都是單獨的反應器,包括一個待測序的 DNA 模板片段。加入一種 dNTP 后,如果加入的這一種 dNTP 和模板中的引導核苷酸互補,就會形成互補 鏈。在這一過程中釋放出一個氫離子,引起 PH 值的改變,從而激發芯片感受器,表明發生了一個反應。因此能夠將遺傳信息(DNA)直接翻譯成數碼信息(DNA 序列)。其優勢主要在于高效而成本低廉。

            Q:做家系連鎖分析若做測序,是做兩個病人好還是一個病人一個正常
            A:連鎖分析:是單基因遺傳病定位克隆方法的核心。它是利用遺傳標記在家系中 進行分型(Genotyping),再利用數學手段計算遺傳標記在家系中是否與疾病產 生共分離。連鎖分析是利用連鎖的原理研究致病基因與參考位點(遺傳標記)的關 系。根據孟德爾分離率,如果同一染色體上的位點不連鎖,那么遺傳標記標將獨立于致病基因而分離,與致病基因位于同一單倍體或不同單倍體的機會各占一半, 否則表明連鎖的存在
            如果一個家系要做連鎖分析,首先應該判斷該疾病是否為遺傳病。在排除家 族性疾病后,再確定它的遺傳方式。必須確定了遺傳方式才能做連鎖分析,所以 與做兩個病人好還是一個病人一個正常沒有關系,檢測的數量越多越好。

            Q:ion torrent 與 illumina 二代測序的優劣比較
            A:ion torrent 測序主要用于小基因組物種,如細菌和病毒,其優勢簡單、快速、 成本低。而 illumina 測序應用更廣泛,多用于擁有較大基因組的物種。

            Q:X10 文庫的插入片段是多大?
            A:插入片段是以 350Bp 為主峰的 Covaris 打斷片段。

            Q:X10 的測序數據產量是多少?
            A:X10 每個樣本至少要測 90G PF data。Illumina 公司保證每個文庫在正常上 機條件下,可以產出 90G PF data,如果少于 90G PF data,Illumina 包賠。也就是說:X10 可以測大于等于 90G/文庫的數據量,不可以測少于 90G 的數據 量。

            Q:我有 200 個樣本要測,但是測序價格還是太貴了
            A:二代測序的特點是全面掃描,快速發現可能的目標基因,但是成本還是較高。 所以您可以選擇 20 個樣本做一下測序,發現了潛在幾個目標基因之后,再進行 針對性的定量 PCR、siRNA 干擾等實驗進后期驗證。這樣成本不會太高,又可 能很快鎖定目標基因。 

            Q:你們跟華大比,有什么優勢?
            A:華大是一家測序規模很大的公司,測序是研究的一種手段,相對于研究手段, 我們更加關注為客戶提供優質、快捷的服務,作為研究的一部分,我們不僅僅提供測序,我們還會為您規劃測序前的樣本組合設計,服務于測序后的信息分析, 針對您的方向,找到測序結果中您的關鍵結果。

            Q:什么是 Q30?
            A:Q30是指一個堿基的識別可靠性等于99.9%,或者說出錯可能性是0.1%。 Q20則是指堿基識別的可靠性等于99%。 Q30數據量是指一批數據中,質量高 于等于Q30的數據的量的總和。

            Q:X10 交付的是什么數據?什么文件格式?
            A:X10 交付的是PF 數據。注意:不是Clean data。 文件格式是FASTQ 文件。

            Q:測序數據的PF data/PF reads是什么意思?
            A:PF是pass filter的意思。也就是質量合格的意思。Illumina的測儀序會自動地對一個read(序列)的質量可靠性進行打分。對于前25個堿基中的是否有兩個堿 基的識別可靠性低于0.6,是PF的判斷標準。這句話翻譯成較容易理解的話: 就
            是前25個堿基中,如果低質量的數據有2個或更多,則這條read被判定為不合格, PF就不通過。反之,則質檢通過。

            Q:石蠟樣本是否可以用Highseq X-Ten檢測
            A:可以用X-Ten檢測,相對來說CNV和SV檢測不準確,但已有文獻發表。建議
            用外顯子測序。

            Q:X10 對樣本的數量、質量如何要求?
            A:要求每樣本2 微克以上抽提好的人全基因組DNA ,濃度大于50ng/uL, OD260/280 在1.8~2.0 之間。

            Q:關于做人的先天性缺陷的全基因組測序的測序深度和數據量各是多少?
            A:建議測序深度為50X,數據量為90G。

            Q:X10的測序數據產量是多少?
            A:X10每個樣本至少要測90G PF data。Illumina公司保證每個文庫在正常上機 條件下,可以產出90G PF data,如果少于90G PF data,也就是說:X10可以測大于等于90G/文庫的數據量,不可以測少于90G的數據量。
             
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