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            科研動態

            文獻解讀 | miR-154-5p通過靶向CUL2抑制宮頸癌變中的

            來源:小博發布時間:2020-07-29

            題目:MicroRNA-154-5p regulates the HPV16 E7-pRb pathway in Cervical Carcinogenesis by targeting CUL2

            客戶單位:山西醫科大學
            中康博提供:
            1. 基因芯片檢測(Affymetrix miRNA 4.0 array)

            2. 生物信息學分析(聚類圖、趨勢分析、功能和通路富集分析)

             

            推薦語

            宮頸癌是由HPV持續感染引起的,死亡率很高。E3泛素連接酶cullin2(CUL2)是HPV16-E7介導的視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)降解的關鍵。miRNAs在腫瘤發生過程中發生失調,但miRNAs與宮頸癌特異性CUL2之間的關系仍然未知。本研究使用Affymetrix  miRNA芯片檢測宮頸癌組織中miRNA的表達,然后通過PCR在130例活檢標本中發現miR-154-5p在腫瘤進展過程中下調。生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗表明miR-154-5p直接作用于CUL2-3'UTR。為了研究miR-154-5p及其靶標CUL2的功能,構建miR-154-5p模擬物、miR-154-5p抑制劑或CUL2  siRNA轉染HPV16陽性宮頸癌細胞株(SiHa),然后通過CCK8細胞計數試劑盒、傷口愈合實驗和侵襲實驗等實驗檢測轉染細胞的增殖、遷移和侵襲能力,結果發現:miR-154-5p表達增加可顯著降低SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲,而miR-154-5p抑制劑則相反。CUL2沉默與miR-154-5p類似,降低SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲,同時也增加了pRb的表達。最終證明miR-154-5p通過靶向CUL2  3'UTR來調節pRb的表達,從而在HPV16-E7誘導的宮頸癌發生中發揮抑癌作用。

             

            樣本情況

            2016年1月至2018年1月,山西醫科大學第二醫院共收集了130例人類宮頸活檢標本,研究對象均為在山西居住5年以上的漢族人。兩次病理檢查證實腫瘤發生。排除白血病、肝病或其他腫瘤患者。沒有病人在獲得組織前接受放療或化療。在獲得所有參與者的書面知情同意后,通過陰道鏡檢查子宮頸組織活檢,并立即將樣本保存在-80°C的冰箱中。130例人類宮頸活檢標本包括:

            • HPV16+正常組:HPV16陽性正常宮頸(n=35)

            • HPV16+宮頸上皮內瘤變組:HPV16陽性CIN1(n=31)、HPV16陽性CIN2/3(n=33)、

            • HPV16+鱗狀細胞癌組:HPV16陽性SCC(n=31),根據2009年國際婦產科聯合會(FIGO)分期標準,Ia期12例,Ib期7例,IIa期12例。按病理分型,高分化9例,中分化20例,低分化2例。

            • 芯片檢測樣本:從130例患者中選擇25例年齡匹配的樣本。

              • 10例鱗狀細胞癌組織

              • 10例CIN3組織

              • 5例正常宮頸組織

             

            研究結果
            不同分組宮頸組織的miRNA表達譜和數據分析

            三分組:10例鱗狀細胞癌組織、10例CIN3組織和5例正常宮頸組織,即癌癥組、瘤變組、正常組。

            通過Affymetrix miRNA 4.0芯片檢測miRNA,并進行三組比較,發現共有77個miRNAs差異表達(圖2A、2B)。在miRbase和TargetScan中預測77個差異表達的miRNAs的靶基因,以重疊基因作為最終數據集,最終共預測了2618個靶基因。GO富集分析確定了Wnt信號、蛋白質泛素化(特別是泛素依賴的蛋白質分解代謝過程)、轉化生長因子β受體信號,以及參與調節上皮-間質轉化和轉錄調控的基因(圖2C)。此外,KEGG富集分析確定了磷脂酶D信號通路、MAPK信號通路、mTOR信號通路,以及參與腫瘤中膽堿代謝和甘油磷脂代謝的基因(圖2D)。

             

            CUL2是miR-154-5p的直接靶點

            生物信息學預測發現:CUL2  3'UTR可能被17個差異表達的miRNAs靶向;其中miR-154-5p的得分最高(圖3A,見表3)。

             

            miR-154-5p可能與CUL2上的兩個區域結合(圖3B),并且在不同物種之間高度保守(圖3C)。這些結果表明miR-154-5p能與CUL2  3'UTR形成穩定而緊密的結合。此外,雙熒光素酶報告試驗表明,與NC對照相對,轉染有miR-154-5p模擬質粒的細胞相對熒光素酶活性顯著降低。這些結果共同證實了miR-154-5p和CUL2之間的直接結合(圖3D)。

             

             

            miR-154-5p抑制SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲

            CIN1、CIN2/3和SCC中miR-154-5p的表達水平均低于正常宮頸,與miRNA芯片結果一致(圖4A)。此外,兩種人類宮頸癌細胞系(SiHa和Caski)中miR-154-5p水平也低于293T(圖4B)。用miR-154-5p模擬物或miR-154-5p抑制劑轉染SiHa細胞,觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。通過熒光顯微鏡和RT-qPCR檢測miR-154-5p水平,驗證轉染效率。熒光顯微鏡檢測顯示所有組的轉染效率都超過90%(圖4C)。RT-qPCR結果顯示miR-154-5p模擬轉染后miR-154-5p水平顯著高于模擬NC,而miR-154-5p抑制劑轉染后miR-154-5p水平明顯低于抑制劑NC(均P<0.001)(圖4D)。與相應的NC組相比,轉染miR-154-5p模擬物降低了SiHa細胞的增殖,而miR-154-5p沉默增加了細胞增殖(兩者均P<0.05,圖4E)。轉染miR-154-5p模擬物抑制SiHa細胞遷移,而轉染miR-154-5p抑制劑與轉染相應的NCs相比增強了細胞遷移(均P<0.05,圖4F,4G)。與相應的NC相比,轉染miR-154-5p模擬物的SiHa細胞的侵襲能力下降了54.76%,而轉染miR-154-5p抑制劑的SiHa細胞的侵襲能力提高了63.41%(兩者P<<0.05,圖4H,4I)。

             

            miR-154-5p通過靶向CUL2介導pRb的表達

            miR-154-5p可直接與CUL2的3'UTR結合。為了進一步闡明miR-154-5p是否會對CUL2的表達產生抑制作用,研究對轉染的SiHa細胞進行了western印跡分析。轉染后72小時,轉染miR-154-5p模擬物的細胞中CUL2蛋白的表達低于模擬NC,而miR-154-5p抑制劑處理組的CUL2蛋白表達高于抑制劑NC(均P<0.05,圖5A,5B)。與CUL2表達觀察到的變化直接相反,轉染miR-154-5p模擬物的細胞中pRb的表達高于模擬NC,而轉染miR-154-5p抑制劑的細胞中pRb的表達低于抑制劑NC(兩者均P<0.05,圖5C,5D)。此外,Pearson相關分析顯示CUL2和pRb表達呈負相關(r=-0.879,P<0.001,圖5E)。

             

            CUL2敲除抑制SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲,并增加pRb的表達

            將CUL2-siRNA轉染SiHa細胞,觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。熒光顯微鏡檢測顯示轉染效率超過90%(圖6A)。Western  blot分析顯示,轉染CUL2 siRNA的細胞在轉染72小時后,與siRNA  NC相比,CUL2蛋白水平顯著降低(P<0.001,圖6B,6C)。在轉染CUL2  siRNA后的48h和96h,CUL2蛋白敲除降低了SiHa細胞的增殖(均P<0.05,圖6D)。此外,與轉染后48小時的siRNA-NC相比,CUL2-siRNA顯著抑制SiHa細胞的遷移(P<0.05,圖6E,6F)。與siRNA  NC相比,CUL2  siRNA組中SiHa細胞的侵襲能力降低了46.34%(P=0.0112,圖6G,6H)。在用CUL2-siRNA轉染SiHa細胞72小時后,pRb的表達高于siRNA-NC(P<0.05,圖6I,6J)。

             

            研究結論

            研究表明miR-154-5p通過靶向CUL2  3'UTR在抑制HPV16-E7介導的pRb降解中起著關鍵作用,這提示miR-154-5p是治療HPV誘發宮頸癌的潛在靶點。

             


            北京中康博生物科技有限公司(beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD)是北方乃至全國最大的Affymetrix檢測中心之一,公司以數據分析為特色,整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代測序、個性化生物信息分析三項核心服務。立足生命科學,為臨床與基礎研究領域的科學工作者提供分子生物學高端技術服務。

             

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