題目：MicroRNA-154-5p regulates the HPV16 E7-pRb pathway in Cervical Carcinogenesis by targeting CUL2

客戶單位：山西醫科大學

中康博提供：

1. 基因芯片檢測（Affymetrix miRNA 4.0 array）

2. 生物信息學分析（聚類圖、趨勢分析、功能和通路富集分析）

推薦語

宮頸癌是由HPV持續感染引起的，死亡率很高。E3泛素連接酶cullin2（CUL2）是HPV16-E7介導的視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）降解的關鍵。miRNAs在腫瘤發生過程中發生失調，但miRNAs與宮頸癌特異性CUL2之間的關系仍然未知。本研究使用Affymetrix  miRNA芯片檢測宮頸癌組織中miRNA的表達，然后通過PCR在130例活檢標本中發現miR-154-5p在腫瘤進展過程中下調。生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗表明miR-154-5p直接作用于CUL2-3'UTR。為了研究miR-154-5p及其靶標CUL2的功能，構建miR-154-5p模擬物、miR-154-5p抑制劑或CUL2  siRNA轉染HPV16陽性宮頸癌細胞株（SiHa），然后通過CCK8細胞計數試劑盒、傷口愈合實驗和侵襲實驗等實驗檢測轉染細胞的增殖、遷移和侵襲能力，結果發現：miR-154-5p表達增加可顯著降低SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲，而miR-154-5p抑制劑則相反。CUL2沉默與miR-154-5p類似，降低SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲，同時也增加了pRb的表達。最終證明miR-154-5p通過靶向CUL2  3'UTR來調節pRb的表達，從而在HPV16-E7誘導的宮頸癌發生中發揮抑癌作用。

樣本情況

2016年1月至2018年1月，山西醫科大學第二醫院共收集了130例人類宮頸活檢標本，研究對象均為在山西居住5年以上的漢族人。兩次病理檢查證實腫瘤發生。排除白血病、肝病或其他腫瘤患者。沒有病人在獲得組織前接受放療或化療。在獲得所有參與者的書面知情同意后，通過陰道鏡檢查子宮頸組織活檢，并立即將樣本保存在-80°C的冰箱中。130例人類宮頸活檢標本包括：

• HPV16+正常組：HPV16陽性正常宮頸（n=35）

• HPV16+宮頸上皮內瘤變組：HPV16陽性CIN1（n=31）、HPV16陽性CIN2/3（n=33）、

• HPV16+鱗狀細胞癌組：HPV16陽性SCC（n=31），根據2009年國際婦產科聯合會（FIGO）分期標準，Ia期12例，Ib期7例，IIa期12例。按病理分型，高分化9例，中分化20例，低分化2例。

• 芯片檢測樣本：從130例患者中選擇25例年齡匹配的樣本。

  • 10例鱗狀細胞癌組織

  • 10例CIN3組織

  • 5例正常宮頸組織

研究結果

不同分組宮頸組織的miRNA表達譜和數據分析

三分組：10例鱗狀細胞癌組織、10例CIN3組織和5例正常宮頸組織，即癌癥組、瘤變組、正常組。

通過Affymetrix miRNA 4.0芯片檢測miRNA，并進行三組比較，發現共有77個miRNAs差異表達（圖2A、2B）。在miRbase和TargetScan中預測77個差異表達的miRNAs的靶基因，以重疊基因作為最終數據集，最終共預測了2618個靶基因。GO富集分析確定了Wnt信號、蛋白質泛素化（特別是泛素依賴的蛋白質分解代謝過程）、轉化生長因子β受體信號，以及參與調節上皮-間質轉化和轉錄調控的基因（圖2C）。此外，KEGG富集分析確定了磷脂酶D信號通路、MAPK信號通路、mTOR信號通路，以及參與腫瘤中膽堿代謝和甘油磷脂代謝的基因（圖2D）。

CUL2是miR-154-5p的直接靶點

生物信息學預測發現：CUL2  3'UTR可能被17個差異表達的miRNAs靶向；其中miR-154-5p的得分最高（圖3A，見表3）。

miR-154-5p可能與CUL2上的兩個區域結合（圖3B），并且在不同物種之間高度保守（圖3C）。這些結果表明miR-154-5p能與CUL2  3'UTR形成穩定而緊密的結合。此外，雙熒光素酶報告試驗表明，與NC對照相對，轉染有miR-154-5p模擬質粒的細胞相對熒光素酶活性顯著降低。這些結果共同證實了miR-154-5p和CUL2之間的直接結合（圖3D）。

miR-154-5p抑制SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲

CIN1、CIN2/3和SCC中miR-154-5p的表達水平均低于正常宮頸，與miRNA芯片結果一致（圖4A）。此外，兩種人類宮頸癌細胞系（SiHa和Caski）中miR-154-5p水平也低于293T（圖4B）。用miR-154-5p模擬物或miR-154-5p抑制劑轉染SiHa細胞，觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。通過熒光顯微鏡和RT-qPCR檢測miR-154-5p水平，驗證轉染效率。熒光顯微鏡檢測顯示所有組的轉染效率都超過90%（圖4C）。RT-qPCR結果顯示miR-154-5p模擬轉染后miR-154-5p水平顯著高于模擬NC，而miR-154-5p抑制劑轉染后miR-154-5p水平明顯低于抑制劑NC（均P<0.001）（圖4D）。與相應的NC組相比，轉染miR-154-5p模擬物降低了SiHa細胞的增殖，而miR-154-5p沉默增加了細胞增殖（兩者均P<0.05，圖4E）。轉染miR-154-5p模擬物抑制SiHa細胞遷移，而轉染miR-154-5p抑制劑與轉染相應的NCs相比增強了細胞遷移（均P<0.05，圖4F，4G）。與相應的NC相比，轉染miR-154-5p模擬物的SiHa細胞的侵襲能力下降了54.76%，而轉染miR-154-5p抑制劑的SiHa細胞的侵襲能力提高了63.41%（兩者P<<0.05，圖4H，4I）。

miR-154-5p通過靶向CUL2介導pRb的表達

miR-154-5p可直接與CUL2的3'UTR結合。為了進一步闡明miR-154-5p是否會對CUL2的表達產生抑制作用，研究對轉染的SiHa細胞進行了western印跡分析。轉染后72小時，轉染miR-154-5p模擬物的細胞中CUL2蛋白的表達低于模擬NC，而miR-154-5p抑制劑處理組的CUL2蛋白表達高于抑制劑NC（均P<0.05，圖5A，5B）。與CUL2表達觀察到的變化直接相反，轉染miR-154-5p模擬物的細胞中pRb的表達高于模擬NC，而轉染miR-154-5p抑制劑的細胞中pRb的表達低于抑制劑NC（兩者均P<0.05，圖5C，5D）。此外，Pearson相關分析顯示CUL2和pRb表達呈負相關（r=-0.879，P<0.001，圖5E）。

CUL2敲除抑制SiHa細胞的增殖、遷移和侵襲，并增加pRb的表達

將CUL2-siRNA轉染SiHa細胞，觀察其對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。熒光顯微鏡檢測顯示轉染效率超過90%（圖6A）。Western  blot分析顯示，轉染CUL2 siRNA的細胞在轉染72小時后，與siRNA  NC相比，CUL2蛋白水平顯著降低（P<0.001，圖6B，6C）。在轉染CUL2  siRNA后的48h和96h，CUL2蛋白敲除降低了SiHa細胞的增殖（均P<0.05，圖6D）。此外，與轉染后48小時的siRNA-NC相比，CUL2-siRNA顯著抑制SiHa細胞的遷移（P<0.05，圖6E，6F）。與siRNA  NC相比，CUL2  siRNA組中SiHa細胞的侵襲能力降低了46.34%（P=0.0112，圖6G，6H）。在用CUL2-siRNA轉染SiHa細胞72小時后，pRb的表達高于siRNA-NC（P<0.05，圖6I，6J）。

研究結論

研究表明miR-154-5p通過靶向CUL2  3'UTR在抑制HPV16-E7介導的pRb降解中起著關鍵作用，這提示miR-154-5p是治療HPV誘發宮頸癌的潛在靶點。

 

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