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            科研動態

            文獻解讀 | miR-203靶向Runx2抑制異位骨化!

            來源:小博發布時間:2020-07-29

            本期介紹一篇骨異化相關的高通量miRNA文章,發表在Cell Death and Disease, 影響因子5.72。骨異化研究方向的小伙伴可以參考下,文章不是最近的,但可以作為“骨異化+高通量檢測”這類組合研究的入門案例。經檢索,骨異化方向的高通量文章并不是很多,只有少量的mRNA和miRNA研究。因此,在骨異化研究領域可以嘗試與mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA和單細胞等層面相結合,進一步拓寬研究面!

             

            研究背景

            異位骨化癥(HO)是臨床上具有破壞力的并發癥,定義為通常不發生骨骼的軟組織中存在片狀骨。盡管HO可能由骨化性纖維增生癥(FOP)引起,但通常在骨折和脫位后發現。HO經常出現在關節周圍的軟組織內,導致關節僵硬、神經束縛和持續性疼痛。雖然HO的發病機理尚不清楚,但已經確定了可能導致此過程的幾個因素,如成骨細胞的不當增殖和分化促進了骨的形成。此外,已發現很多的miRNA可以調節成骨分化標記基因的表達,但它們在HO病理生理機制中的功能作用仍有待確定。

             

            樣本選擇及差異篩選

            • 分組及樣本:正常組和HO組,骨組織樣本,每組5個重復,共10個樣本。正常骨組織取自正常人的外傷截肢。

            • 基因芯片檢測:文中采用基因芯片進行miRNA和mRNA的表達量檢測。

            • 差異篩選及PCR驗證:與正常骨組織相比,HO組織的miR-203水平顯著降低。此外,通過PCR檢測了15個正常骨組織樣本和30個HO組織中Runx2 的表達水平,結果發現Runx2在HO組織樣品中顯著上調。最后,通過線性回歸發現HO樣品中Runx2 與miR-203表達之間存在顯著的負相關關系。

             

             

            功能研究——確認Runx2是miR-203的直接靶標!

            先前的研究表明,β-catenin和細胞外信號調節激酶(ERK)通過參與Runx2相關通路來參與骨形成。miR-203過表達后顯著降低了Runx2,β-catenin和p-ERK的水平。相反,miR-203敲降后會增加Runx2,β-catenin和p-ERK蛋白的水平。miR-203對Runx2 mRNA表達有影響,但是不影響β-catenin(CTNNB1基因)和ERK(MAPK1基因)mRNA表達。

             

            機制研究——miR-203具體是怎么作用的?

            為了研究miR-203是否通過Runx2調節β-catenin和ERK信號傳導,將hFOB1.19細胞與Runx2 siRNA和antagomiR-203共轉染,結果發現Runx2敲低可抑制antagomiR-203激活ERK和β-catenin。然后將hFOB1.19細胞與Runx2過表達質粒和agomiR-203共轉染,結果表明Runx2的重新表達挽救了agomiR-203的抑制作用。這些數據表明miR-203以Runx2依賴性方式抑制ERK和β-catenin信號傳導。

            接下來,使用Targetscan和miRBase預測miR-203和Runx2的靶向結合關系,發現在Runx2 mRNA的3'-非翻譯區(UTR)中確定了miR-203的四個miRNA調控元件(MRE)(P1-P4)。將這四個部分3'-UTRs分別克隆到熒光素酶開放閱讀框下游的pGL3報告載體中,結果發現,用P1熒光素酶報告基因加miR-203轉染的細胞表現出明顯更低的熒光素酶活性。此外,還發現agomiR-203對熒光素酶活性的抑制是劑量依賴性的。為了證明miR-203的特異性,轉染miRNA抑制劑antagomiR-203特異性地消除了熒光素酶活性。接著,構建一個包含miR-203-結合位點突變序列(MUT-Runx2-3'-UTR)的Runx2 3'-UTR熒光素酶報告基因,并用agomiR-203或agomiR-NC轉染了hFOB1.19細胞,結果發現,miR-203的過表達抑制了Runx2 3'-UTR報告基因的熒光素酶活性,而序列內的突變則消除了這種抑制作用。

             

            為了研究miR-203在成骨細胞分化中的作用,分別用agomiR-203或antagomiR-203轉染hFOB1.19細胞以分別過表達或敲降miR-203,然后在成骨誘導培養基(OM)中進行培養。染色實驗顯示,miR-203的過表達抑制了成骨細胞的成骨分化,而miR-203的敲降則促進了成骨分化過程。為了闡明成骨細胞分化過程中miR-203的表達特征,將hFOB1.19細胞在OM中培養21天,在此成骨過程中,miR-203的表達逐漸降低。此外,從成骨細胞分化開始,Runx2,β-catenin和p-ERK蛋白水平強烈增加,并一直保持高水平直至第21天(礦化階段)。agomiR-203轉染可降低Wnt 3a的表達水平,而antagomiR-203處理可增強Wnt 3a的表達。Runx2 siRNA轉染后可顯著降低成骨標記基因ALP,BSP和OCN的mRNA水平。此外,Runx2 siRNA轉染完全阻斷了miR-203的作用,這表明miR-203在成骨細胞分化中的功能是Runx2依賴性的。(細胞水平)

            臨床HO樣品顯示Runx2表達升高,β-catenin和ERK信號激活。從肘部創傷患者中切除HO病變,并以正常骨骼作為對照。將所有骨頭脫礦質并進行免疫組織化學測定,結果發現,與正常骨骼相比,HO組織中Runx2,β-catenin和p-ERK的表達增加,且復發性HO中的Runx2表達水平高于原發性HO。但是,原發性和復發性HO組之間的β-catenin和p-ERK表達水平沒有顯著差異。接下來,PCR結果表明HO組織中ALP,BSP和OCN mRNA水平升高。復發性HO組中ALP和OCN的表達水平顯著較高,而BSP表達無顯著差異。此外,將復發性HO組織與原發性HO組織進行比較,發現在復發性樣本中miR-203表達水平較低,而Runx2表達水平較高。(臨床水平)

             

            為了進一步驗證了miR-203是否在體內具有重要作用。小鼠進行了切腱術以產生創傷性HO模型。為了檢查治療效果,隨后每周在病變部位注射agomiR-203或antagomiR-203(80 mg / kg)對小鼠進行治療。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)作為對照。用agomiR-203治療的小鼠的HO顯著低于NC組,而antagomiR-203治療則增加了HO的體(圖6a和b)。此外,使用agomiR-203治療的小鼠的HO組織的miR-203水平升高,而用antagoomiR-203治療的miR-203水平降低。收集HO損傷并進行免疫組化測定,發現agomiR-203治療后Runx2,β-catenin和p-ERK的表達降低,而antagomiR-203治療后其表達增加。(動物水平)

             

            五.最后的結論

            研究發現在創傷性HO模型中,agomiR-203的藥物治療可有效減少骨骼外骨骼的形成。此外,miR-203是通過抑制其靶標Runx2的轉錄后水平來發揮相應功能。

            參考文獻:miR-203 inhibits the traumatic heterotopic ossification by targeting Runx2.

             


            北京中康博生物科技有限公司(beijing Cnkingbio Biotechnology Co.LTD)是北方乃至全國最大的Affymetrix檢測中心之一,公司以數據分析為特色,整合Affymetrix基因芯片、Illumina二代測序、個性化生物信息分析三項核心服務。立足生命科學,為臨床與基礎研究領域的科學工作者提供分子生物學高端技術服務。


             

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